Влияние аспирации фолликулярной жидкости

Предполагается, что недостаточно высокая эффективность лечения бесплодия с помощью МВР в определенной степени сопряжена с эндокринными нарушениями, возможно, возникающими в лютеиновую фазу лечебного цикла в связи с попутной аспирацией при получении ооцитов значительного объема гормонсодержащей фолликулярной жидкости и клеток гранулезы, способных, находясь в организме женщины в естественных условиях, оказывать благоприятное влияние на процессы трансформации эндометрия и имплантации. То есть, в этом случае может возникать, так называемый, "дефект лютеиновой фазы" (Gonen c соат., 1991). Вместе с тем, вопросы ведения лютеиновой фазы индуцированного цикла, имеющие существенное значение для достижения беременности, вряд ли можно считать однозначно решенными (Furman с соавт., 1986). Существующие при этом указания по назначению гестагенов и хорионического гонадотропина в различных режимах и дозах, не имеют достаточного патогенетического обоснования.
В связи с этим мы попытались изучить возможное влияние аспирации фолликулярной жидкости (ФЖ) на гормональный профиль бесплодных женщин в процессе их лечения методом ЭКО и, при выявлении дефекта лютеиновой фазы, наметить пути его коррекции. В этих целях провели сравнение содержания Е2 и П в естественных (119) и стимулированных (746) менструальных циклах у пациенток, которым производилась (697) и непроизводилась (168) пункция фолликулов и аспирация ФЖ. Кровь для исследования содержания гормонов брали на +1 и +5 дни цикла; нулевым считали день естественной овуляции или пункции фолликулов. Данные о содержании гормонов представлены в табл 8.

Представленные данные безусловно свидетельствуют о достоверном снижении Е2 и П на +1 день цикла и повышении концентрации этих гормонов на +5 день при аспирации фолликулов (p<0,05) по сравнению с циклами без проведения аспирации. Причем, выявленная закономерность не была связана с индукцией суперовуляции как таковой и не зависила от характеристик используемых схем. То есть, аспирация ФЖ действительно приводит к гормональному дефекту, который на следующий после пункции день носит характер дефицита, а на +5 день - избытка Е2 и П. Кроме того, после аспирации фолликулов в сыворотке крови пациенток было попутно зарегистрировано достоверное увеличение концентрации ФСГ на +1 день цикла, по сравнению с больными у которых аспирация не производилась (p<0.05).
Полученные данные легко объяснить общепринятым на сегодняшний день представлением о наличии механизма положительной обратной связи: после аспирации ФЖ дефицит половых стероидов на +1 день цикла стимулирует выброс гонадотропинов, а последние, в свою очередь, - синтез половых гормонов клетками гранулезы. Избыток этих гормонов может, по всей видимости, неблагоприятно влиять на процессы имплантации эмбрионов.
В свете полученных данных понятно, что введение экзогенных половых стероидов, не только не обеспечивает необходимую коррекцию, но и способно усугубить имеющийся дефект.
Основываясь на этом, мы исследовали возможность коррекции выявленного дефекта путем возвращения ФЖ в брюшную полость сразу же после извлечения содержимого фолликулов. Оценка влияния этого способа компенсации лютеинового дефекта на параметры, характеризующие гормональный профиль больных,

Как показали результаты исследования, концентрация половых гормонов в сыворотке крови пациенток, которым производилась аспирация ФЖ без ее последующего возвращения в брюшную полость, на +1 день мониторированного цикла оказалась достоверно ниже (p<0,05) значений аналогичных гормонов у больных после возвращения ФЖ. Концентрация гормонов в последней группе в свою очередь статистически достоверно не отличалась (p>0,05) от концентрации Е2 и П в сыворотке крови больных без аспирации ФЖ.
Анализ клинических данных (табл.10) показывает, что возвращение ФЖ в брюшную полость ведет к повышению частоты наступления беременности на 5,7%, снижению частоты "биохимических" беременности на 7,8%, спонтанных абортов на 0,9% и преждевременных родов - на 2,6%.

Таким образом, аспирация ФЖ ведет к существенным не физиологическим колебаниям концентраций половых гормонов - резкому их падению сразу после аспирации и компенсаторному резкому повышению на +5 день цикла. Подобная ситуация, по всей видимости, может являться неблагоприятной для имплантации эмбрионов.
Проведенная работа свидетельствует, что возвращение ФЖ в брюшную полость немедленно после извлечения из нее ооцитов представляется адекватным и перспективным способом коррекции дефекта лютеиновой фазы, возникающего после пункции фолликулов и аспирации их содержимого, т.к. приводит к нивелированию вызванных гормональных изменений и улучшает клинические результаты лечения бесплодия методом ЭКО.
Этот способ можно расценивать как альтернативный при необходимости поддержки лютеиновой фазы, в случаях угрозы возникновения синдрома гиперстимуляции яичников или индивидуальной непереносимости применяемых для этого препаратов.

Белки, ассоциированные с беременностью.
Естественно предположить, что для повышения эффективности метода ЭКО необходимо не только улучшение практического выполнения каждого из его этапов, но и дальнейшее более глубокое и всестороннее исследование и осмысление процессов, ответственных за репродукцию.
После открытия в 70-е годы группы белков, ассоциированных с беременностью (Ю.С.Татаринов, В.Н.Масюкович, 1970; Д.Д.Петрунин с соавт., 1976; Bohn, 1971), было начато изучение их содержания в организме и выяснение значения каждого из них. Большинство ученых (Ю.С.Татаринов, 1988; Л.В. Посисеева с соавт., 1992; Lopata, 1991 и др.) считают, что эти белки играют важную роль в осуществлении репродуктивной функции у человека.
Однако, до настоящего времени в научной литературе крайне мало публикаций о количественных соотношениях белков, ассоциированных с беременностью, в жидкости преовуляторных фолликулов при наличии или отсутствии в ней ооцитов, а также при различных состояниях яйцеклеток. Практически нет данных о динамике содержания этих белков в сыворотке крови в течение первых дней после зачатия или после переноса эмбрионов в матку, при наступлении или ненаступлении беременности. Не получено убедительных данных о физиологическом значении этих белков в период созревания гамет, оплодотворения и на самых ранних этапах эмбриогенеза, о точном времени начала их синтеза новым организмом и возможности их участия в процессе имплантации и развития беременности.
Возможность проведения исследований в этом направлении и побудила нас к изучению белков, ассоциированных с беременностью: плацентарного ?1 микроглобулина (ПАМГ-1), ?2- микроглобулина фертильности (АМГФ), ? фетопротеина (АФП) и хорионического гонадотропина (ХГ), при лечении бесплодия методом ЭКО.
Изучение содержания этих белков было проведено в биологических жидкостях полученных у 473 супружеских пар в 642 попытках лечения: в фолликулярной жидкости (ФЖ) 374 женщин в 472 попытках лечения, сыворотке крови 184 пациенток в 212 попытках, нативной сперме и взвеси капацитированных сперматозоидов 242 мужчин и 672 образцах культуральной среды.
В результате анализа полученных данных оказалось, что в сыворотке крови АФП обнаруживался лишь у 6.5% женщин, а в ФЖ не выявлялся ни у одной пациентки, что свидетельсвует о непроницаемости для него гемато-фолликулярного барьера. Наличие в ФЖ повышенных концентраций ПАМГ-1 (в среднем до 13.7±3.2 мкг/л) и АМГФ (в среднем до 5.7±0.9 мкг/л) в сочетании со сниженным (после экзогенного введения) содержанием в ней ХГ (в среднем до 78.1± 29.6 МЕ/л) оказалось характерным признаком синдрома "пустого фолликула".
Наряду с этим было обнаружено, что частота оплодотворения in vitro и интенсивность последующего дробления эмбрионов находятся в обратной (линейной) зависимости от концентрации ПАМГ-1 в ФЖ и прямой - от содержания в ней ХГ и концентрации АМГФ в нативной сперме и среде инсеминации. При отсутствии АМГФ в среде культивирования гамет оплодотворение ооцитов in vitro вообще не происходило, а при снижении концентрации этого белка в нативной сперме до 22 мг/л (или превышении 200 мг/л) и в среде инсеминации - до 4.5 мг/мл случаев наступления беременности зарегистрировано не было (табл. 11).

Прогностически благоприятными при лечении бесплодия методом ЭКО оказались следующие концентрации белков, ассоциированных с беременностью: ХГ в ФЖ во время пункции фолликулов - 253,3± 44.2 МЕ/л, АМГФ в сперме - 105,2±36,9 мг/л, во взвеси капацитированных сперматозоидов - 0,27±0,1 мг/л и среде культивирования гамет - 6,2±1,6 нг/л.
При наступлении беременности концентрация АМГФ и ХГ в сыворотке крови пациенток прогрессивно возрастала. Причем, содержание АМГФ изменялось значительно быстрее и к 13 дню после переноса эмбрионов в 4.5 раза превышало исходный (в день пункции) уровень этого белка, тогда как содержание ХГ возрастало за этот период всего в 2 раза.
В безуспешных попытках лечения концентрация АМГФ возрастала за этот период только в 2 раза, при одновременном снижении содержания ХГ до 0.
Таким образом, результаты изучения содержания белков, ассоциированных с беременностью, в жидкости преовуляторных фолликулов, сыворотке крови бесплодных пациенток, а также сперме и среде культивирования гамет показывают, что эти белки играют существенную роль в процессах воспроизводства и полученные данные могут быть использованы для характеристики фолликулов и ооцитов оплодотворяющей способности спермы и прогнозирования результатов лечения бесплодия методом ЭКО.

Влияние различных факторов на эффективность лечения .
Несмотря на достаточную унификацию МВР, имеющуюся в различных клиниках мира, эффективность их использования варьирует в значительных пределах - от 15 до 50% наступления беременности на цикл лечения (Mc Laren, 1995; Farhi с соавт.,2000 и др.). Несомненно, это связано с контингентом больных, различающихся по своим возрастным и другим клиническим характеристикам.
Нами проведен анализ результатов лечения бесплодия методом ЭКО с учетом этих характеристик у 1489 пациенток в возрасте от 18 до 35 лет (в среднем 30.9+2.7 года), не подвергнутых специальной выборке, у которых наступило 170 беременностей.
Для статистической обработки полученных данных и установления причинно-следственной связи между ними была применена специальная программа многофакторного компьютерного анализа с использованием системы управления базами данных. Анализировали конечный результат лечения (отправная точка анализа) и значения 20 факторов, от которых этот результат мог бы зависеть: возраст пациентки и масса ее тела, наличие в анамнезе аллергических реакций, беременностей, абортов и родов, продолжительность бесплодия, число предыдущих попыток лечения методом ЭКО, наличие гирсутизма и галактореи, состояние маточных труб, матки и яичников, результаты измерения Бt и исследования спермы мужа (I-II степень олиго-астено-тератозооспермии), форма бесплодия, толщина эндометрия в день пункции фолликулов, число пунктированных фолликулов, число перенесенных эмбрионов и максимальное число бластомеров в них, а также время года.
При помощи программного анализа оценивали как влияние каждого из указанных факторов на результаты лечения методом ЭКО, так и их сочетаний, пытаясь установить роль этих факторов в убывающей по значению последовательности, а также благоприятные и неблагоприятные для исхода лечения комбинации.
Анализируя полученные данные оценки единичных факторов, мы пришли к следующему заключению: Эффективность лечения достоверно ниже (p<0.05) в группе женщин 35-40 лет, по сравнению с другими возрастными группами, что подтверждает зависимость исхода лечения от возраста пациентки. Сама по себе продолжительность бесплодия определенно не сказывается на результатах лечения (p>0.05). Однако, учитывая, что этот фактор связан с возрастом пациентки, целесообразно рассматривать их в сочетании.
Наиболее неблагоприятными факторами, отрицательно влияющими на исход лечения, явились: Резекция яичников в анамнезе - в группе женщин с резецированным одним яичником эффективность лечения составила 18% на лечебный цикл, тогда как при резекции обоих яичников она снижалась в 2 раза. Консервативная миомэктомия в анамнезе снижала эффективность лечения на 9 %, тогда как наличие субсерозной или интерстициальной миомы матки размерами до 3-х см не влияло на его исход. Гирсутизм и повышенная масса тела снижали эффективность лечения на 8-10 %, умеренные нарушения сперматогенеза у мужа на 10-12 %, наличие сактосальпинксов - в 2 раза.
То есть, указанные факторы негативно отражались на результатах применения метода ЭКО, несмотря на происходившее оплодотворение ооцитов и дробление эмбрионов до их переноса в матку.
Вместе с тем, не обнаружено достоверного (p>0,05 ) отрицательного влияния на исход лечения таких факторов как аллергические реакции, галакторея без явлений гиперпролактинемии и гипотиреоза, беременности, аборты и роды в анамнезе, изменения Бt, та или иная форма бесплодия и время года.
К наиболее важным в прогностическом отношении единичным факторам, возникающим в процессе проведения лечения по общепринятой программе ЭКО, мы отнесли число переносимых в матку эмбрионов и число бластомеров в них, а также толщину эндометрия в день пункции фолликулов.
Среди исходных факторов, существовавших к началу лечения и не зависящих от вмешательства, наиболее значимыми представлялись: возраст пациентки, масса ее тела, перенесенные ранее оперативные вмешательства на яичниках и матке, а также качество спермы мужа. Степень влияния этих факторов на результаты лечения не одинакова. Вклад возникающих факторов в вектор общего влияния на исход лечения, принятого за 100 %, составляет 14,0%, 68,6 % и 17,4 %, а указанных исходных факторов - 32,2%, 16,9 %, 12,5 %, и 10,4 %, соответственно.
Проведенный многофакторный анализ исходных факторов позволил определить их наиболее благоприятную, в смысле наступления беременности после применения метода ЭКО, комбинацию, соответствующую результатам проведенного анализа значения единичных факторов.
Наименее благоприятная комбинация возникающих в процессе лечения факторов: толщина эндометрия в день пункции фолликулов менее 1.0 см в сочетании с переносом в матку 2 зигот, предполагает чрезвычайно низкую вероятность наступления беременности. Наилучшие же результаты лечения можно ожидать при толщине эндометрия более 1 см и переносе 4 эмбрионов на стадии 4 бластомеров.
Таким образом, полученные данные позволяют ориентироваться в характере и степени влияния различных факторов и их сочетаний на исход лечения бесплодия методом ЭКО, а также, в определенной мере, прогнозировать результаты его применения у каждой конкретной супружеской пары. Это, можно надеяться, будет способствовать более правильному отбору больных для лечения МВР, что повысит эффективность лечения.

Применение криоконсервации эмбрионов в программе ЭКО.
Сейчас не вызывает сомнений, что замораживание гамет (сперматозоидов и ооцитов) и эмбрионов, полученных после оплодотворения in vitro, и последующее их оттаивание для использования в целях достижения беременности у бесплодных супружеских пар имеет большое практическое значение. Такой подход к сохранению репродуктивного материала, с одной стороны, позволяет отсрочить или продолжить лечение пациентки МВР при отсутствии по каким-либо причинам ее мужа, а с другой, при возникновении опасных или неясных ситуаций, например, в случаях возникновения или угрозы развития тяжелой клинической картины синдрома гиперстимуляции яичников, дает возможность воздержаться от переноса эмбрионов в матку в текущем менструальном цикле и осуществить его в последующих циклах.
Наиболее важное значение имеет криоконсервация эмбрионов, оставшихся после переноса части из них в лечебном цикле. При ненаступлении беременности они могут быть перенесены в матку в последующих циклах, не трубующих повторной стимуляции суперовуляции и получения яйцеклеток, и тем самым снизить стоимость лечения, оградить пациентку от дополнительной моральной и физической травмы и, самое главное, повысить у нее эффективность лечения.
Если методика криоконсервации сперматозоидов и их применения при осуществлении внутриматочной инсеминации и МВР хорошо отработана и, по всей вероятности, не требует уточнения, а замораживания/оттаивания ооцитов пока что нуждается в существенном совершенствовании и еще не получила признание, то вопросы, касающиеся внедрения в практику криоконсервации эмбрионов и их использования при лечении бесплодия, по крайней мере в нашей стране, ждут незамедлительных ответов. Последнее обстоятельство побудило нас поделиться некоторыми результатами, полученными в этой области.
В период с 1.01.1996г. по 3.09.1999г. у пациенток, включенных в программу ЭКО, после переноса им в матку 3-4 полноценных эмбрионов, оставшиеся зародыши , находившиеся на стадии 2-8 бластомеров, подвергали программированному замораживанию с последующим хранением в жидком азоте (методика приведена в разделе "Методы лечения бесплодных супружеских пар"). Поскольку у этих пациенток в лечебном цикле беременность не наступила, в последующих 1-5 циклах их криоконсервированные эмбрионы размораживали и при их жизнеспособности перенос производили повторно. Результаты применения программы ЭКО+КРИО представлены в табл. 12.

Как следует из этой таблицы из 116 циклов, в которых проводилось оттаивание эмбрионов, только в 98 осуществлялся перенос эмбрионов в матку пациентки, что объясняется потерями эмбрионов как связанными с их разрушением в процессе замораживания/оттаивания и хранения, так и с утратой ими жизнеспособности.
Подтверждением последнего предположения может служить существенная разница между числом в большей или меньшей степени интактных (не разрушенных) эмбрионов и числом не погибших (548 против 344). Наблюдалась и значительная частота потери эмбрионами интактности более 50% (204 из 548).
Частота наступления беременности при использовании в программе ЭКО+КРИО замороженных/оттаянных эмбрионов оказалась довольно существенной - 16,1% из расчета на число пациенток и 14,3% - на число переносов, хотя и не совсем сопоставимой с результатами лечения бесплодия стандартным методом ЭКО.
Тем не менее, общая эффективность лечения бесплодных пациенток с подключением дополнительных переносов в матку размороженных эмбрионов возрастала как минимум в 1,5 раза, при репродуктивных потерях, составляющих 21,4% (3 беременности из 14). Четырнадцать родившихся при этом детей не имели отклонений в развитии.
Таким образом, внедрение в практику лечения бесплодия программы ЭКО+КРИО представляется весьма целесообразным, поскольку без повторного проведения стимуляции суперовуляции, выполнения пункции фолликулов и значительных дополнительных затрат позволяет кардинально улучшить результаты лечения бесплодия.